RNAの回収を行った後、cDNAを作製するためのプロトコール。
今回紹介するのはSuper Script II Reverse Transcriptaseを利用した場合です。
Super Script II は長さにして12.3kbまでのcDNA作製を保証しています。
また、M-MLV RTのRNaseH活性を除去しているものになるため、RNaseHによる影響がなくなっています。
Super Script II で上手くワークしない場合はSuper Script IIIという製品も出ており、より良いとのことです。
こちらはより高い温度でも機能するため特異性に優れているそうですが、当方ではあまり使用しておりません。
ですが、また時間があるときにSuper Script IIIのバージョンもプロトコールを載せたいと考えております。
[Materials]
・抽出したRNA(1 ng – 5µg)
・Super Script II Reverse Transcriptase(RT)
・5x First Buffer (250 mM Tri-HCl, pH8.3 at room temperature; 375 mM KCl; 15 mM MgCl2)
・ 0.1 M DTT
上記三つはSuper Script II RT 購入時にセットで入っている。
・10mM dNTP Mix
・RNase Out (40 units/µL)*
・Oligo(dt)12-18 (500µg/mL)： (もしくは50-250 ng random primer か 2 pmol gene specific primerを用いる)
*RNase Outは50 ng以下のRNAからcDNAを作製する場合は特に入れることが推奨されている
[Method]
1. 以下の溶液とRNAを混ぜ合わせて作製。
| total RNA(1 ng – 2.5 µg) | X µl |
| Oligo(dt)12-18 (500µg/mL) (もしくはrandom primerかGSP) |
0.5 µl |
| 10 mM dNTP Mix (もしくは2.5 mM dNTP) |
0.5 µl (2 µl) |
| DEPC水 | total 6 µlになるようにする |
2. 65℃にて5min。
3. on ice
4. 以下の溶液を作製しておき、サンプルにアプライ。
| 5x First-Strand Buffer | 2 µl |
| 0.1 M DTT | 1 µl |
| RNase Out* | 0.5 µl |
| Super Script II RT** | 0.5 µl |
*RNase Outを入れない場合は代わりにDEPC水を入れる
**ss-を作製する場合は代わりにDEPC水を入れる
**RNAの量が1 ng以下の場合には Super Script II RTを0.125 µl(50 unit)にする。
(before5 random primerの場合は25℃で 10minの処理を入れる)
5. 42℃で50min
6. 70℃にて15min
7. cDNAの完成
8. 必要に応じて水で希釈をしておく。(例えば90 µlの水で10倍希釈しておく等)
9. -20℃にて保存
参考文献に挙げている本家のプロトコールとは異なる点がいくつかあります。
一つは溶液のボリュームを半分で行っている事です。通常RT-PCRを行う際には希釈したものをテンプレートにして十分のため、コストの面を考え半分になっています。
さらにSuper Script II RTを加えるタイミングが少し異なります。4.の作業を行う際にSuper Script II RTは入れずに、42℃で2minの後に添加するよう書いてありますが、ロスなどの可能性及び当方では省いてみても問題がなかったことから除かれています。
上記のプロトコールで上手く行かない場合は分けてみるのも手かもしれません。
関連記事
・ Super Script III Reverse Transcriptase を用いた逆転写反応
参考文献
・スーパースクリプト II 逆転写酵素(invitrogen )の製品添付書