Super Script III Reverse Transcriptase を用いた逆転写反応

2012/4/26 2012/12/27 Blog

RNAの回収を行った後、cDNAを作製するためのプロトコール。

今回紹介するのはSuper Script III Reverse Transcriptaseを利用した場合です。

Super Script III RTはSuper Script II RTと異なり長さにして12.3kbを超えるcDNA作製も保証しています。

さらに、複雑な二次構造のあるRNAも逆転写が可能になっています。

これはSuper Script II RTにポイントミューテーションを入れることで、50℃での半減期が伸びた為とのことです。

また、M-MLV RTのRNaseH活性を除去しているものになるため、RNaseHによる影響がなくなっています。

[Materials]

・抽出したRNA(1 ng – 2.5 µg)

・Super Script II Reverse Transcriptase(RT)
・5x First Buffer (250 mM Tri-HCl, pH8.3 at room temperature; 375 mM KCl; 15 mM MgCl2)
・ 0.1 M DTT

上記三つはSuper Script III RT 購入時にセットで入っている。

・10mM dNTP Mix
・RNase Out (40 units/µL)*
・Oligo(dt)12-18 (500µg/mL)： (もしくは50-250 ng random primer か 2 pmol gene specific primer(GSP)を用いる)

*RNase Outは50 ng以下のRNAからcDNAを作製する場合は特に入れることが推奨されている

[Method]

1. 以下の溶液とRNAを混ぜ合わせて作製。

total RNA(1 ng – 5µg)	X µl
Oligo(dt)20(50 µM) もしくは Oligo(dt)12-18 (500µg/mL)* (もしくはrandom primerかGSP)	0.5 µl
10 mM dNTP Mix (もしくは2.5 mM dNTP)	0.5 µl (2 µl)
DEPC水	total 6 µlになるようにする

*製品添付書には20 µlの系で200-500ngのOligo(dt)12-18と書いてあります。

2. 65℃にて5min。
3. on ice
4. 以下の溶液を作製しておき、サンプルにアプライ。

*RNase Outを入れない場合は代わりにDEPC水を入れる
**ss-を作製する場合は代わりにDEPC水を入れる
**RNAの量が1 ng以下の場合には Super Script II RTを0.125 µl(50 unit)にする。

(5-0. random primerの場合は25℃で 5minの処理を入れる)

5. 50℃で30-60min
(GSPの場合や二次産物があるときは 55℃行う)

6. 70℃にて15min

7. cDNAの完成

8. 必要に応じて水で希釈をしておく。(例えば90 µlの水で10倍希釈しておく等)
9. -20℃にて保存

参考文献に挙げている本家のプロトコールとは異なる点がいくつかあります。

一つは溶液のボリュームを半分で行っている事です。通常RT-PCRを行う際には希釈したものをテンプレートにして十分のため、コストの面を考え半分になっています。