「プロトコール」一覧

RNAの回収を行った後、cDNAを作製するためのプロトコール。 今回紹介するのはSuper Script II Reverse Transcriptaseを利用した場合です。 Super Script II は長さにして12.3kbまでのcDNA作製を保証しており、ほぼ全長のcDNAが得られると考えられています。 また、M-MLV RTのRNaseH活性を除去しているものになるため、RNaseHによる影響がなくなっています。

簡単、迅速にゲノムDNAを抽出するメソッド第二弾です。 ジェノタイピング(genotyping)などの操作を行う際にゲノムDNAの抽出作業が必要になりますが、この操作を知っていると少し楽になるかもしれません。

簡単、迅速にゲノムDNAを抽出するメソッドです。 ジェノタイピング(genotyping)などの操作を行う際にゲノムDNAの抽出作業が必要になりますが、この操作を知っていると少し楽になるかもしれません。 proteinase K(proK)で一晩とかした後にフェノール・クロロホルム(フェノクロ精製)を用いてDNA精製をする方が一番スタンダードな抽出方法ではないでしょうか？ しかしながら、実験の都合上もっと素早くDNAを抽出してgenotypingを行う必要性がある方もいらっしゃるでしょう。 もしくは、大量のgenotypingを余儀なくされている研究者の方にとっても、フェノクロ精製はメンドクサイものだと思います。 金銭的に余裕のある研究室や共同研などの外部施設が充実してい場合ですと、DNA自動分離装置(クラボウ)などの機械が出ておりますが、根本的な解決には至っておりません。 今回、紹介するのは非常に素早くDNAを抽出でき、しかもローコストなメソッドです。 ですが、完全にキレイなDNAを抽出できるわけでなく、参考文献によると"汚い"DNA精製となっております。

細胞を扱う方々の多くは培地を作製した際に血清を加える必要があります。 血清を加えないと大体の動物細胞は生育ができません。 これは血清中に含まれるホルモンの供給源として、培地の緩衝作用の増強、フェノールレッドや 各種プロテアーゼからの保護効果があります。 しかしながら、その一方で未知の物質が多く血清の代わりとなる物質が見つかっていないため、仕方なく血清を使っているのです。 血清の多くは市販されておりFBS(ウシ胎児血清)、NBS(新生児牛血清)などが挙げられます。 値段は大分高いので、わからずに使っている方は調べてみてください。 血清の選び方などはまたそのうちに書こうと思います。 血清は基本的に滅菌済みになっています。 血清を実験操作の都合上、改めて滅菌する必要などがある場合は、0.45 µm か0.22 µmのfilterで滅菌しましょう。 ですが、滅菌済をした上で実際に実験を行うには血清の非働化をすることが多いです。 まずは、そのプロトコールを以下に示します。

マウスケラチノサイトの単離と培養のプロトコール。 マウスケラチノサイトの初代培養はヒトに比べて大変難しく、 継代を行うと細胞の増殖能の低下や形態変化が如実に現れます。 継代は50回以上可能であると書いてあるプロトコールもあれば、 継代は勧めないという書籍もあります。 かつては、非常にケラチノサイトの培養は難しく物理的な刺激でも、分化が始まってしまったりすると教わってきた時期もありましたが、近年では有用なmediumが増えてきており、そこまで神経質にならなくとも培養は可能です。 (それこそ継代を５０回以上行いたいなどとなれば、よほど神経質に行う必要がでてくるでしょうが。。) お勧めしているのはCELLnTEC社のPCT培地です。

アゾ化合物であるトリパンブルーは死んだ組織や細胞を簡単に染め分けてくれます。 尚、死細胞の染色は可能ではありますがアポトーシスやネクローシスの判別などはつきません。 トリパンブルーがタンパク質と結合することで青色になるのですが、死細胞が染まるのは細胞膜が壊れて細胞質が出るためです。