in situ hybridizationの詳細プロトコール/BraInSitu

in situ hybridization(ISH)法という実験手法があります。

wikipediaには

サザンブロッティングやノーザンブロッティングとは異なり、DNA や RNA を抽出せずに、in situ(それらが存在する本来の場所で、すなわち細胞中もしくは組織中で)ハイブリダイゼーションによって検出する。

と説明があります。

通常mRNAの発現などを調べるには、

組織などから抽出をした後にPCRを行うことが多いでしょう。

ですが、ISH法を扱えば、

組織中の切片において、どこの部分でmRNAが発現しているかを視覚的にとらえることができます。

もちろん組織だけでなく細胞中においても使用可能です。

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(wikipediaより転載)

例えば上記の図を見てください。

ショウジョウバエの胚発生を各ステージでISH法でmRNAの発現を調べています。

発生のステージごとに全く異なる発現パターンをしていることがわかると思います。

なお、この図で見ている遺伝子は分節遺伝子のうち、hunchback遺伝子だそうです。

興味のある方は調べてみてください。

しかしながら、ISH法はそれなりの技術の取得が求められます。

今回紹介するのは、ISH法について詳しく説明をしているwebサイト、BranInSituです。

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基礎生物学研究所の脳生物学研究部門山森研究室渡我部博士が運営をしているそうです。

以下に解説へのリンクを貼付けておきます。

1. ISH法の原理
2. 実験ステップの説明1) 概略
2) プローブの作成
3) ISH法による脳切片の染色
3. ISHの結果を左右するパラメータについて1) プロトコルの選択
2) プローブについて
3) 固定について
4. ISH法の応用

  • 1) 2重ISH法
  • 2) ISH法のさらなる応用

プロトコールはPDFにて無料配布をしてくださっており、

こちらのアドレス(http://www.nibb.ac.jp/brish/Technique/protocollink.html)より、

確認してください。

以下のようなプロトコールなどが紹介されています。

プ ローブ合成法(鋳型作りからアンチセンスRNA)
浮 遊法:単プローブISH
浮 遊法:2重蛍光ISH(単プローブISHも)
ス ライドガラス法:単、2重蛍光ISH
ス ライドガラス法:単、2重蛍光ISH
RNA 精製法(キット不使用)
RT-PCRによる遺伝子断片クローニング
中規模プラスミド精製(キット不使用)

今回紹介しただけでなく、ISH法で染色したギャラリーや、細かい疑問へのQ & Aのコーナーもあります。

大変素晴らしいサイトですので、ISH法を使っている方、これから使いたいという方は是非アクセスしてみてください。

アクセスはコチラ

出典

BranInSitu基礎生物学研究所

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